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              與日俱進丨集團免疫組庫測序技術重磅升級!

              2018-08-01 閱讀數:13480

              為抵御各種各樣的病原體,人類或哺乳動物的適應性免疫系統擁有大量的T細胞受體(TCRs)和B細胞受體(BCRs),統稱為免疫組庫。高通量測序(NGS)技術允許對T或B細胞克隆進行深入分析,能夠在檢測T或B細胞時提供前所未有的精細度。



              該技術可以有效評估TCR或BCR互補決定區域(CDR3)的多樣性,并評估克隆類型的構成:包括特定克隆類型的比例;克隆之間的相似程度;V(D)J基因的使用頻率;核苷酸插入與缺失;CDR3區域長度分布等信息。因此,免疫組庫高通量測序為評估健康或疾病狀態下的機體適應性免疫系統提供了可能。


              高通量測序技術可快速便捷地對免疫組庫進行全景式的掃描,但其涉及的PCR反應會導致假陽性增加以及擴增偏倚,從而對數據結果的準確性造成潛在影響。

              目前,現有的免疫組庫技術主要分為兩類:


              1.基于多重PCR的文庫構建方案:以DNA為模板,針對可變區(CDR3)設計多對引物,擴增出CDR3區段,再進行文庫構建并測序;

              2.基于5'RACE的文庫構建方案:以mRNA為模板,在恒定區設計引物逆轉錄擴出TCR或BCR的全長序列,經過兩輪PCR富集這一目的序列,再進行文庫構建并測序。

              但是,現有的基于多重PCR的文庫構建方案存在明顯不足之處:該方法同時進行幾十種引物的擴增,體系異常復雜;多重引物設計需已知參考序列,不能充分捕捉到人類等位基因突變序列;多種引物擴增效率可能存在偏倚,難以等效擴增;與使用mRNA構建文庫相比,DNA所需的PCR反應體系較大,樣本要求較高。

              技術升級一:

              廣州華銀健康科技有限公司推出全新的免疫組庫測序技術服務,基于5'RACE原理,并在原始模板擴增前引入UMI(Unique Molecular Indices,分子條形碼)進行文庫構建:以恒定區單引物逆轉錄擴增出CDR區

              域全長序列的同時,引入UMI序列,可對后續PCR反應或測序過程中引入的錯誤進行有效糾正,從而提高準確率。

              技術升級二:

              在逆轉錄環節,廣州華銀健康科技有限公司設計了針對微量樣品(低至100個細胞)的實驗流程:即通過oligo dT磁珠捕獲mRNA,以磁珠上的oligo dT為逆轉錄引物合成cDNA,并純化回收cDNA,較常規方法可大大提高效率,保證了人或小鼠來源的微量樣品的實驗成功率。


              全新免疫組庫測序技術服務亮點

              1.可滿足微量樣品建庫的實驗要求(最低可至100個細胞),兼容人以及小鼠樣本


              微量RNA起始建庫流程圖


              2.低RNA起始量的樣本也能快速達到測序飽和期,相同RNA起始量下的樣本其相關度較高


              同一樣本RNA起始量不同時到達測序飽和期數據統計曲線圖


              同一樣本RNA起始量相同時樣本間的相關性圖
              (A1/A2/A3為起始RNA量為1600ng; B1/B2/B3為起始量為400ng; C1/C2/C3為起始量為50ng)

              3.基于強大的UMI標記與校正算法,可有效糾正PCR與測序過程引入的錯誤與偏倚,極大地提高準確度


              經過UMI算法校正后的部分測試數據統計表

              4.對測序下機數據進行多維度分析,給出最全面的數據結果報告,并可定制個性化分析服務




              參考文獻:
              1.Abbas A K, et al. Cellular & Molecular Immunology 6e[J].
              2.Hou X L, et al. Current status and recent advances of next generation sequencing techniques in immunological repertoire[J]. Genes & Immunity, 2016, 17(3):153.
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              4.Chunlin Wang, et al. High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among human T cell subsets. PNAS, 2010, vol. 107:1518–1523.
              5.Jennifer Benichou, et al. Rep-Seq: uncovering the immunological repertoire through next-generation sequencing. Immunology, 2011, 135: 183–191.
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              8.Evaggelia Liaskou, et al. High-throughput T-cell receptor sequencing across chronic liver diseases reveals distinct disease-associated repertoires. Hepatology, 2015,1-10.
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